Rubins Suche nach enhancern

Edward Rubin spricht auf dem EMBO meeting 2010 über seine Forschung, die Suche nach “enhancern” und deren Identifizierung in der nichtkodierenden Region, über die verwendeten Methoden und die Nutzung dieses neuen Wissens.

`We run a big sequencing lab´, dies sind einige der ersten Worte von Eddy Rubin am Montag den 6. September, als er auf dem EMBO meeting in Barcelona sich und seine Arbeit einführt. Er ist der Sequenzierexperte für den die Annotation eines neuen Gens oder Genabschnittes sicher nichts aussergewöhnliches mehr ist. Er will sich die Arbeit allerdings etwas erschweren, indem er sich in unbekannte Gefilde vorwagt, wie die nicht kodierenden Regionen der DNA.

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E.Rubin at the EMBO meeting 2010

Welche Bedeutung hat sie und beherbergt sie möglicherweise “enhancer”, also Verstärkerelemente für Gene die weit entfernt liegen?

Laut Rubin gibt es eine Vielzahl dieser enhancer und sie können über weite Distanzen die örtliche und zeitliche Aktivität eines Gens beeinflussen. Als Beispiel nennt er den limb enhancer, der mehr als 1 megabase (1 Millionen Bsaenpaare) vom Shh Gen (Sonic Hedgehog) entfernt liegt und dessen Deletion bei Mäusen zu fehlenden Extremitäten führt (hier der link zum Review Artikel dazu).

Die Herausforderung für ihn: solche enhancer in der nicht kodierenden Region zu identifizieren und Aussagen über ihre örtliche und zeitliche Aktivierung treffen können. Um dieses Ziel zu erreichen nutzt sein Labor entweder komparative Studien oder führt Untersuchungen mit Hilfe von ChiP-Seq Sequenzierungen von Geweben aus definierten Regionen durch.

Der experimentelle Ansatz beginnt mit dem Vergleich von Sequenzen verschiedener Organismen. Während die kodierenden Regionen meist konserviert sind, finden sich auch in der nicht kodierenden Region solche Bereiche. Um zu testen ob sie einem enhancer entsprechen wird die Region mittels einer PCR amplifiziert, in einen entsprechenden Vektor kloniert und in eine befruchtete Maus-Eizelle eingebracht. Die reimplantierten Embryos werden dann am Tag E11.5 präpariert und mitteles LacZ Färbung untersucht. Auf diese Weise hat er schon 1000de solcher enhancer getested und eine enhancer browser Bibliothek erstellt.

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E.Rubin at the EMBO meeting 2010

Sie ist für jedermann zugänglich und bietet die Möglichkeit per Gen oder Zugangsnummer eine Suche zu starten die sogar mit den entsprechenden Bildern der zu erwartenden Expressionsmuster belohnt wird.

Auch wenn in Zukunft weiter munter solche Elemente getestet und annotiert werden sollen, so macht er die limitierenden Punkte auch sehr deutlich. 1. Es gibt keine Information über wann und wo die gefundenen enhancer nun wichtig sein könnten, 2. Es werden nur solche enhancer getestet, die in der nicht-kodierenden Region liegen und 3. die Erfolgsrate dieser Methode liegt bei 47%.

Der zweite Ansatz ist spezifischer und beruht auf ChiP-Sez Analysen. Dabei wird zur Spezifizierung der p300 Coaktivator verwendet, der zwar nicht direkt an die DNA bindet, aber für eine Transkription rekrutiert und im Komplex gebunden werden muss. Gewebe von spezifischen Regionen (Mittelhirn, Vorderhirn und Extremitäten)wurde gesammelt, Protein:DNA crosslink Experimente durchgeführt, die DNA anschliessend zerkleinert und mit Hilfe von Antikörperbindungen isoliert. Der nächste Schritt beinhaltete eine NEXT Gensequenzanalyse und eine kritische Auswertung der erhaltenen peaks (sehr schön hier graphisch dargestellt). Unter Berücksichtigung der evolutionären Konservierung des peaks wurden predictors, also Vorhersager bestimmt und in Folgeexperimenten validiert.

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E.Rubin at the EMBO meeting 2010

Mit einer Erfolgsrate von 70-80% konnten diese vorhergesagten Gene validiert werden. Die p300 Besetzung definiert daher mit ziemlicher Genauigkeit die zeitliche und örtliche Präsenz eines enhancers. Diese Studien ergaben besonders gute Werte für das Vorderhirn und im Gegensatz dazu realtive geringe Erfolgsraten bei Geweben wie Herz. Auch diesem Sachverhalt ging Rubins Gruppe nach. Sie isolierten Herzen und verglichen die p300 peaks zwischen Maus und humanem Gewebe mit hoher bzw. schwacher Einschränkung. Dabei stellten sie fest, dass viele enhancer im Herzen niedrig konserviert sind und daher bei komparativen genomischen Studien meist ausser Acht gelassen wurden.

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E.Rubin at the EMBO meeting 2010

Betrachtet man also die weniger konservierten Bereiche und achtet weiterhin auf die p300-assoziierten enhancer, so können eine Fülle solcher spezifischen enhancer in Herzen von 11,5 Tage alten Mausembryonen identifiziert werden. Relativ neu sind diese Daten, die im August 2010 in  Nature genetics preäsentiert wurden.

Laut Rubin würde er gerne diese Daten als ergänzende Information bei der typischen Suche nach Genen einfügen. Als Beispiel zeigt er die nebenstehende Folie, die Aussage über all die Dinge gibt, die für einen Forscher wichtig sind, wie das Gen, die Lage, die dazugehörenden enhancer, das Gewebe in dem sie exprimiert werden etc.

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Visel A, Rubin EM, & Pennacchio LA (2009). Genomic views of distant-acting enhancers. Nature, 461 (7261), 199-205 PMID: 19741700


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Blow MJ, McCulley DJ, Li Z, Zhang T, Akiyama JA, Holt A, Plajzer-Frick I, Shoukry M, Wright C, Chen F, Afzal V, Bristow J, Ren B, Black BL, Rubin EM, Visel A, & Pennacchio LA (2010). ChIP-Seq identification of weakly conserved heart enhancers. Nature genetics, 42 (9), 806-10 PMID: 20729851

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